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獲獎(jiǎng)人簡(jiǎn)介：

Emmanuelle Charpentier博士，法籍微生物學(xué)家，現(xiàn)為德國(guó)馬克斯·普朗克研究所感染生物學(xué)研究所所長(zhǎng)。在CRISPR的發(fā)展中，其主要的貢獻(xiàn)在于發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白的活性仰賴tracrRNA。

Jennifer A. Doudna博士，為伯克利大學(xué)化學(xué)和分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教授，霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究員，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士。她與Emmanuelle Charpentier博士共同發(fā)現(xiàn)Cas9 的切割作用和，crRNA 的定位作用，并將crRNA與tracrRNA可以融合成單鏈引導(dǎo)RNA（sgRNA）。

相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜曳治龇Q，華人科學(xué)家張鋒首先在真核細(xì)胞內(nèi)采用CRISPR-Cas9實(shí)現(xiàn)基因編輯，但他未能獲獎(jiǎng)，可能是因?yàn)閺堜h的工作原創(chuàng)性要低一些，他的貢獻(xiàn)更像當(dāng)初細(xì)胞重組中科恩和伯耶的貢獻(xiàn)（1980年化學(xué)獎(jiǎng)當(dāng)年人工重組給的是伯格）；而且化學(xué)獎(jiǎng)更注重體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，他的突破主要體現(xiàn)在細(xì)胞方面。

CRISPR已經(jīng)是目前生物醫(yī)學(xué)方面非常普及的的基因編輯技術(shù)，近幾年該技術(shù)的飛速發(fā)展，推廣應(yīng)用到了生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域，造就了一批批科研奇跡，尤其是在遺傳病的治療、疾病相關(guān)基因的篩查與檢測(cè)、腫瘤治療以及動(dòng)植物的改造、病原微生物防治等領(lǐng)域有著巨大的潛力，也將深遠(yuǎn)地影響整個(gè)世界。

1. 什么是CRISPR

CRISPR的全稱是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，中文翻譯為“規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)”。這個(gè)詞的字面意思就是“代表了同一類特征明顯、排列整齊、秩序一致的重復(fù)序列”。它作為細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，當(dāng)外源病毒或質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，專門的Cas蛋白會(huì)將外源DNA剪成小片段，并將它們粘貼到自身的DNA片段中存儲(chǔ)。當(dāng)再次遇到病毒入侵時(shí)，細(xì)菌能夠根據(jù)存儲(chǔ)的片段識(shí)別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效^[1]。

科學(xué)家利用CRISPR的這一功能，將其改造成為一種革命性的新型分子工具。由于它具有精準(zhǔn)的定位和切割任何種類的遺傳物質(zhì)的能力，使得科學(xué)家能夠更得心應(yīng)手地破解地球上任何生物 (包括人類) 的生命密碼。

2. CRISPR 簡(jiǎn)史

圖1：CRISPR發(fā)展簡(jiǎn)史

CRISPR的發(fā)現(xiàn)與命名

早在1987年，日本大阪大學(xué)的Nakata研究組在分析大腸桿菌時(shí)就發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中存在一些異常重復(fù)的序列^[2]。但當(dāng)時(shí)人們并不知道這些重復(fù)序列究竟有什么作用，甚至還沒有正式為這些重復(fù)序列命名。直到20世紀(jì)80年代末，西班牙阿利坎特大學(xué)的Francisco Mojica再次在一種古菌種發(fā)現(xiàn)了類似的重復(fù)序列^[3]，這引起了他極大的興趣。在隨后的研究中，他一直在微生物中尋找類似結(jié)構(gòu)，到2000年他已經(jīng)在20多種不同的微生物種中發(fā)現(xiàn)了這一類似的序列^[4]。2002年，荷蘭烏得勒支大學(xué)的Ruud Jansen發(fā)現(xiàn)不同物種的重復(fù)序列堿基數(shù)存在巨大差異，并且這種序列僅存在于原核生物中。為了更好地規(guī)范相關(guān)的研究，他們共同為這種重復(fù)序列命名為“CRISPR”。。多個(gè)CRISPR相關(guān)基因則被命名為Cas（CRISPR-associated）家族^[5]。

CRISPR-CAS系統(tǒng)的生物學(xué)作用

2005年，CRISPR研究迎來了一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)研究小組（Mojica和Pourcel）都觀察到了CRISPR重復(fù)序列之間的間隔序列并非來自于原核生物自身，而是來源于質(zhì)?；虿《?sup>[6-7]。因此，Mojica提出CRISPR是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的假設(shè)。同年，Bolotin研究組在嗜熱鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了Cas9，并預(yù)測(cè)這個(gè)龐大的蛋白質(zhì)具有核酸酶活性。他們還發(fā)現(xiàn)與病毒同源的間隔序列都具有一種類似的尾巴，稱為PAM（protospacer adjacent motif）序列，它們對(duì)靶序列的識(shí)別至關(guān)重要。

受到這一假說的激發(fā)，當(dāng)時(shí)還在著名的酸奶公司Danisco工作的法國(guó)微生物學(xué)家Rodolphe Barragou決定對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，以解決嗜熱鏈球菌爆發(fā)噬菌體感染死亡而影響酸奶生產(chǎn)的問題。2007年，他們通過實(shí)驗(yàn)證明CRISPR系統(tǒng)確實(shí)是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。嗜熱鏈球菌被病毒入侵后，整合了來自噬菌體基因組新的間隔序列，同樣的病毒再次入侵時(shí)細(xì)菌就有了抵抗攻擊能力^[8]而Cas9蛋白可能是產(chǎn)生這種免疫能力所必需的。這是首次在實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了CRISPR-Cas是一種細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)。

CRISPR-CAS的作用機(jī)制證實(shí)

CRISPR-CAS生物學(xué)功能的證實(shí)，使得許多研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)識(shí)到這一系統(tǒng)的重要性，隨后許多研究團(tuán)隊(duì)紛紛開始補(bǔ)充CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾噬菌體機(jī)制的細(xì)節(jié)。2008年，John van der Oost研究小組在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，來自噬菌體的間隔序列被轉(zhuǎn)錄成小RNA，成為CRISPR RNA（crRNA），并引導(dǎo)Cas蛋白到靶DNA上。Marraffini和Sontheimer在同年證明了CRISPR-Cas系統(tǒng)的目標(biāo)分子是DNA，而不是RNA。他們還明確指出，如果將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到非細(xì)菌系統(tǒng)中，可能成為一種強(qiáng)大的工具系統(tǒng)^[9-10]。這為隨后的基因編輯埋下了伏筆。

2010年12月，Moineau團(tuán)隊(duì)證明了CRISRP-Cas9在PAM序列上游位置的精確切割使DNA雙鏈斷裂。而作為II型CRISPR系統(tǒng)的顯著特征，Cas9是切割唯一需要的蛋白，它與crRNAs共同介導(dǎo)CRISPR-Cas9的干擾功能^[11]。

2011年，Charpentier研究組對(duì)釀膿鏈球菌進(jìn)行了小RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)除了crRNA以外，還存在一種小RNA，稱為式激活CRISPR RNA（tracrRNA）。tracrRNA通過24個(gè)核苷酸與crRNA中的重復(fù)序列互補(bǔ)配對(duì)與形成雙鏈，引導(dǎo)Cas9到靶DNA。至此，天然CRISPR-Cas9干擾機(jī)制的拼圖基本拼搭完整^[12]。

CRISPR-CAS基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)

2012年Charpentier和Doudna團(tuán)隊(duì)合作，不僅證明Cas9具有切割DNA雙鏈的能力，還能夠?qū)racrRNA和crRNA鏈接成sgRNA（single guide RNA），并在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了sgRNA也可以指導(dǎo)Cas9蛋白完成對(duì)DNA的雙鏈剪切。他們可以通過改變crRNA的序列控制Cas9的靶向位點(diǎn)^[13]。隨后Siksnys團(tuán)隊(duì)也報(bào)告了相同的發(fā)現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)不僅是細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)領(lǐng)域的里程碑，更開啟了CRISPR-CAS基因編輯技術(shù)的新篇章。很快，2013年初的多篇論文都將CRISPR-Cas系統(tǒng)成功地應(yīng)用到了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。其中，Church研究組設(shè)計(jì)了II型CRISPR-Cas系統(tǒng)，在人293T細(xì)胞、K562細(xì)胞以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中通過設(shè)計(jì)sgRNA成功靶向特定序列，且多個(gè)gRNA可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的多重編輯^[14]。張鋒實(shí)驗(yàn)室證明了CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以在人類和小鼠細(xì)胞中進(jìn)行精確的定點(diǎn)切割，并且將Cas9突變?yōu)槿笨诿福龠M(jìn)同源修復(fù)過程^[15]。Qi研究組則建立了CRISPRi系統(tǒng)，還實(shí)現(xiàn)了多sgRNAs 靶向多基因 (Tet1、Tet2、Tet3、Sry 和Uty) 的同時(shí)定點(diǎn)突變^[16]。Wu等人利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)Crygc 顯性突變的小鼠進(jìn)行基因治療使其獲得了健康的后代，為CRISPR-Cas9 系統(tǒng)用于遺傳疾病的基因治療提供了依據(jù)^[17]。

由此，CRISPR系統(tǒng)在多種生物的基因定點(diǎn)編輯、基因組篩選、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因組成像、基因診療、生態(tài)應(yīng)用等領(lǐng)域的研究與應(yīng)用開始井噴。隨后幾年，張鋒實(shí)驗(yàn)室更將CRISPR-CAS的基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行了拓展，不僅發(fā)現(xiàn)了在特異性和多基因編輯方面都有著很大優(yōu)勢(shì)的CRISPR-Cas系統(tǒng)：CRISPR-Cpf1^[18]，還發(fā)現(xiàn)具有RNA酶功能的CRISPR酶Cas13a（C2c2）^[19]和Cas13b^[20]。2017年，有多篇文章研究了CRISPR-Cas13系統(tǒng)的作用機(jī)制、在臨床診斷中的應(yīng)用以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞靶向RNA的能力。

3. CRISPR 基因編輯技術(shù)的應(yīng)用

CRISPR技術(shù)迅速發(fā)展使得它在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和疾病治療領(lǐng)域中的應(yīng)用不斷創(chuàng)造出驚喜。2015年Science雜志發(fā)表了成功使用CRISPR治療遺傳性疾病動(dòng)物模型的方法。他們利用CRISPR系統(tǒng)編輯Dystrophin基因，能夠不同程度修復(fù)杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠的肌肉功能，從而達(dá)到治療DMD的效果^[21]。2018年有研究證實(shí)利用CRISPR技術(shù)成功治療了四只患有DMD（Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥）的狗，并將其肌肉和心臟組織中的營(yíng)養(yǎng)不良蛋白恢復(fù)到正常水平的92%^[22]。此外，CRISPR技術(shù)還與細(xì)胞免疫療法相結(jié)合以完善CAR-T療法，并在小鼠中增強(qiáng)了腫瘤抑制作用。首次利用CRISPR-Cas9在T細(xì)胞中敲除PD-1基因的臨床試驗(yàn)已被批準(zhǔn)用于治療肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌、去勢(shì)抵抗性前列腺癌、轉(zhuǎn)移性腎癌和轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌，并在2016年開始了I期臨床試驗(yàn)^[23]。

4. CRISPR的其他應(yīng)用

目前，CRISPR 并不止在基因組編輯得到了應(yīng)用，在基因檢測(cè)方面也展現(xiàn)了巨大的潛力。在2017年Science發(fā)表的研究中，Doudna 團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)很有趣的現(xiàn)象：CRISPR 系統(tǒng)在剪切靶向的雙鏈 DNA 的同時(shí)，Cas12 的 DNA 酶活性會(huì)被激活^[24]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)是否含有某目的DNA 提供了一個(gè)全新的思路：同時(shí)向細(xì)胞內(nèi)遞送靶向該 DNA 的 CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)和非特異性 ssDNA 熒光報(bào)告基因（FQ-labeled reporter），一旦檢測(cè)到目的 DNA，CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)將啟動(dòng)，與此同時(shí)，熒光報(bào)告基因也會(huì)被降解，從而釋放出熒光信號(hào)。利用這一技術(shù)，Doudna 團(tuán)隊(duì)開發(fā)了DETECTR系統(tǒng)，能夠在一小時(shí)內(nèi)100%準(zhǔn)確檢測(cè)出 HPV 16 感染，且單次測(cè)試成本不到一美元。與此同時(shí)，張鋒團(tuán)隊(duì)也利用CRISPR-Cas13a開發(fā)出了SHERLOCK系統(tǒng)和SHERLOCKv2系統(tǒng)^[25]，與Doudna團(tuán)隊(duì)不同，張鋒團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的熒光報(bào)告基因必須是特異性，也正是“特異性”這個(gè)優(yōu)點(diǎn)使得 SHERLOCKv2 可以同時(shí)檢測(cè)多種序列。張鋒團(tuán)隊(duì)還開發(fā)了類似驗(yàn)孕棒的試紙檢測(cè)方法，只需一張?jiān)嚰?，SHERLOCKv2 就能顯示出病毒感染的檢測(cè)結(jié)果，這使得檢測(cè)更為便利。在今年COVID-19的檢測(cè)技術(shù)開發(fā)中，SHERLOCKv2也曾一顯身手。

雖然目前 DETECTR 和 SHERLOCK 已向我們展現(xiàn)出它們?cè)谠\斷中的強(qiáng)大力量，但是在進(jìn)入臨床使用前，為了確保診斷的準(zhǔn)確性，研究者們?nèi)匀恍枰龃罅康墓ぷ?。我們相信這些新的診斷工具必將改寫未來的診斷技術(shù)，尤其是為那些衛(wèi)生條件相對(duì)較差、病毒高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家在病毒感染診斷上帶來巨大的幫助。

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