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羅丹明衍生物和類似物已廣泛用于不同的超分辨率成像技術(shù)，尤其是光活化定位顯微技術(shù)（PALM）。這些羅丹明衍生物和類似物中，羅丹明螺內(nèi)酰胺因?yàn)樵诠庾兩D(zhuǎn)換過程中具有理想的光暗對(duì)比度，所以在PALM成像方面表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)。雖然研究者早就開始對(duì)羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺進(jìn)行修飾，但是幾乎沒有人考慮到PALM成像的一個(gè)重要特征——光變色轉(zhuǎn)換工作時(shí)間。在PALM成像中，空間分辨率和時(shí)間分辨率之間總是不能同時(shí)滿足。

圖1. a)常見羅丹明螺環(huán)內(nèi)酯的光致變色機(jī)理，如Rh-PHT和Rh-MGly；b) 鋅離子型羅丹明螺內(nèi)酯的光致變色機(jī)理；c)肖義教授團(tuán)隊(duì)光致變色機(jī)理，Rh-Gly（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

為了更好地理解酸度對(duì)螺環(huán)內(nèi)酰胺或兩性離子存在的影響，作者測(cè)定了Rh-Gly和類似物Rh-MGly在相同條件下的pKa。結(jié)果表明，Rh-Gly轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的兩性離子不需要強(qiáng)酸性條件，并且兩性離子可以通過“自穩(wěn)定”結(jié)構(gòu)在一定程度上得到穩(wěn)定。這種穩(wěn)定延長(zhǎng)了兩性離子的壽命，有助于提高Rh-Gly的光激活效率。

 圖2. a) 羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺的自發(fā)環(huán)化平衡；b,c) Rh-Gly發(fā)射光譜和pH的關(guān)系（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

因?yàn)榱_丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺在中性介質(zhì)中不斷自發(fā)開環(huán)，Rh-Gly的弱酸性pKa保證了其大部分熒光團(tuán)在生理?xiàng)l件下以非熒光螺環(huán)內(nèi)酰胺的形式存在，從而避免了活細(xì)胞PALM成像過程中信號(hào)重疊。

作者還對(duì)Rh-Gly的光激活條件和單分子熒光工作時(shí)間進(jìn)行了研究。與類似物Rh-MGly和早前報(bào)道的PALM染料Rh-Pht相比，Rh-Gly在單分子水平上延長(zhǎng)工作時(shí)間表現(xiàn)出可重復(fù)性和紫外激活可控性。羧基對(duì)兩性離子的穩(wěn)定作用不僅增加了總光子的聚集，而且提高了單分子的亮度。

圖3. Rh-Gly的光活化、單分子熒光的實(shí)時(shí)測(cè)量及與類似物的比較（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

  緊接著，作者研究了Rh-Gly對(duì)活細(xì)胞線粒體的PALM成像情況。研究結(jié)果表明：Rh-Gly在不同的細(xì)胞系(HeLa和MCF-7)中也顯示出一種特殊的線粒體染色特性。由于工作時(shí)間的延長(zhǎng)，Rh-Gly的活細(xì)胞線粒體PALM成像的瞬時(shí)分辨率被縮短到10秒的同時(shí)，還保留了大約25 nm的定位精度。空間分辨率和時(shí)間分辨率之間的平衡使得Rh-Gly可以用于獲得更多活細(xì)胞線粒體的高質(zhì)量超分辨率圖像。此外延長(zhǎng)的工作時(shí)間使得Rh-Gly具有獲得更寬廣的單分子運(yùn)動(dòng)軌跡的潛力。

圖4. Rh-Gly的雙色共域分析（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖5.在活體HeLa中線粒體富集區(qū)的超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

作者還分別使用HaloTag配體衍生物和異硫氰酸酯衍生物（NCS）修飾Rh-Gly，使得Rh-Gly可以標(biāo)記特殊細(xì)胞。通過自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽，HaloTag配體修飾的Rh-Gly可以用于histone H₂B蛋白在活的HeLa細(xì)胞中的超分辨率成像；通過免疫染色抗體標(biāo)記法，異硫氰酸酯（NCS）修飾的Rh-Gly可以在被固定的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)微管的超分辨率成像。

圖6. 組蛋白的超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖7. 微管超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結(jié)：不同于以往利用羅丹明染料的螺環(huán)對(duì)pH，RNS/ROS等響應(yīng)，大連理工大學(xué)肖義教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種新的羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺染料Rh-Gly解決PALM成像中工作時(shí)間問題，發(fā)展了一種簡(jiǎn)單而有效的延長(zhǎng)光致變色羅丹明螺內(nèi)酰胺工作時(shí)間的策略，有利于PALM成像。通過在靠近內(nèi)酰胺的位置引入一個(gè)羧基，發(fā)揮內(nèi)酸性作用，穩(wěn)定了光產(chǎn)生的兩性離子。Rh-Gly在單分子水平上表現(xiàn)出可重復(fù)和紫外可控的激活能力，延長(zhǎng)了兩性離子的時(shí)間。羧基對(duì)兩性離子的穩(wěn)定作用不僅增加了總光子的收集量，而且提高了單分子的亮度。此外，Rh-Gly在不同的細(xì)胞系(HeLa和MCF-7)中也有特異性的線粒體染色。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活細(xì)胞線粒體PALM成像的時(shí)間分辨率縮短到10 s，定位精度保持在25 nm左右。由于時(shí)空分辨率的平衡，Rh-Gly進(jìn)一步獲得了活細(xì)胞線粒體的一系列超分辨率圖像。HaloTag配體衍生物和異硫氰酸酯衍生物擴(kuò)展了Rh-Gly對(duì)特定細(xì)胞標(biāo)記的功能；通過自標(biāo)記蛋白標(biāo)記和免疫染色方法，這些衍生物能夠?qū)?/span>HeLa細(xì)胞中的組蛋白和微管進(jìn)行高分辨率成像。因此，肖義教授團(tuán)隊(duì)的工作為今后羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺的開發(fā)提供了一條新的途徑。

撰稿人：犟子柳