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利用化學修飾手段對線性多肽進行結構約束是近年多肽藥物化學領域的一個熱門課題。 其中大環(huán)化是多肽修飾最有效的手段之一， 通過對線性肽上的多個側鏈進行交聯形成多環(huán)環(huán)肽也為具有新穎拓撲結構的生物活性分子構建提供新思路。目前制備多環(huán)肽的策略通常是將預制好的模板分子連接到線性肽的側鏈上，這種“嫁接式”的多環(huán)化策略大多被具有高反應活性的半胱氨酸所“壟斷”。因此需要發(fā)展新的具有高靈活度和廣泛適用性的復雜多環(huán)肽合成策略（圖1a）。

圖 1. 化學選擇性修飾構建多環(huán)環(huán)肽

2021年，陳弓課題組利用簡單的甲醛分子(a)實現了對賴氨酸 (Lys，K)和酪氨酸 (Tys，Y)以及賴氨酸 (Lys，K)和精氨酸 (Arg，R)之間的交聯反應，從而開發(fā)了一套簡單實用的策略用于“裝訂”天然多肽（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 6646-6652），分別命名為KaY和KaR反應。在KaR反應中，研究人員發(fā)現甲醛可與胍基和氨基選擇性高效縮合生成四氫三嗪結構 (tetrahydrotriazine, THT)（圖1b）。在此基礎上，課題組對該多組分縮合反應進一步探究。

近日陳弓教授實驗室升級并拓展了KaR反應，利用胺-甲醛-胍（am-a-gu，am代指胺，gu代指胍）三組分反應實現了一種具有廣泛底物普適性和高靈活度的新型多環(huán)化方法。作者通過使用胍基試劑以及簡單的甲醛水溶液，在溫和的條件下便可以實現對未保護的多肽的“縫合”修飾，得到結構新穎的稠合四氫三嗪環(huán)結構（Fused-THT）的同時，還可以構建出復雜、新奇的多環(huán)肽結構（圖2）。

圖 2 胺-甲醛-胍三組分反應構建多環(huán)肽

在底物1中，作者在序列中引入了兩個Lys和一個Arg，以HFIP為溶劑并加入甲醛，室溫下5個小時即可高效地構建稠合的四氫三嗪環(huán)連接結構，并得到了一對具有區(qū)域異構的雙環(huán)多肽（trace-2），并將這類多組分反應命名為K(2)-a-R反應，并且該反應同樣也可以在堿性的PBS緩沖液中順利進行（trace-4）。

普適性研究中，大多數極性的官能團均不會干擾該反應，如羧基(Glu)，羥基(Thr)，咪唑(His)，巰基(Cys)可以通過對序列的調整從而規(guī)避其對反應的干擾(9)。將N端甘氨基作為成環(huán)組分進行GK-a-R成環(huán)時產率較低（12），主要以單環(huán)產物（13）；而將N端換成更長的6-氨基己酸時產率得到明顯提升（14）。作者還可以將K(2)-a-R反應成功應用到構建具有巢狀拓撲結構的三環(huán)多肽（11）。

圖 3 K(2)-a-R反應

接著作者又將K(2)-a-R反應中的固定在肽鏈上的胍基部分(Arg)移除，并引入了鹽酸胍作為胍基組分，同樣實現了多組分縮合反應并構建了一系列環(huán)肽分子，甲醛和胍將多肽上兩個Lys交聯起來構建環(huán)肽的反應，作者命名為K(2)-a-gu反應（gu代指胍）。

如圖4所示，以含有兩個Lys線性肽作為模板肽鏈，加入鹽酸胍和甲醛，以TFE作為溶劑，室溫反應5 h即可高效地得到單一區(qū)域異構體環(huán)肽產物16。同時該反應也可以在水和TFE的混合溶劑中進行，部分水溶性較好的底物可以在PBS緩沖溶液中順利進行。該反應可以兼容幾乎所有的氨基酸種類，并且兩個Lys間距長短對反應的影響也不是很大。各種胍的衍生物如炔基胍、芐基胍（32）、丹磺酰胍（33）以及環(huán)胍（35）也能夠高效率參與到K(2)-a-gu反應中。此外該反應也可以在固相上高效進行，避免了因液相反應中濃度過高產生的分子間交聯副反應的同時，也為高通量合成這類環(huán)肽分子奠定了可能。

圖 4 K(2)-a-gu反應

從環(huán)胍產物35中得到啟發(fā)，作者又利用甲醛、鹽酸胍對線性肽鏈上三個Lys進行關環(huán)，從而高效地得到三環(huán)稠合的三嗪環(huán)（tris-THT）結構并“縫合”出產物37。作者將甲醛和胍以及多肽上三個Lys交聯起來構建雙環(huán)肽的反應命名為K(3)-a-gu反應。

該反應同樣可以兼容各種極性氨基酸（Glu、Asn、Thr等）。此外，同樣利用內酰胺成環(huán)的環(huán)肽，再經過K(3)-a-gu反應從而得到具有類似鳥巢拓撲結構的產物48。最后作者通過一鍋法，先采用K(2)-a-gu反應得到bis-THT結構的環(huán)肽后，再與另外一分子丁胺進行二次縮合得到雜合tris-THT結構的環(huán)肽49。

圖 5 K(3)-a-gu反應

為展示此類反應的應用潛力，陳弓課題組同南開大學郭東升課題組進行合作，利用這類三組分反應所產生的bis-THT和Tris-THT親水性“帽子”嫁接到杯芳烴下緣上（51和55），從而形成具有一定大小的空腔。利用1H NMR滴定法進行鹵負離子 (F-, Cl-, Br-) 的絡合實驗發(fā)現，這種稠合的四氫三嗪環(huán)修飾得到的產物 (55) 室溫下在氘代氯仿中能夠選擇性與F-結合 (3.64 × 103 M?1) ，而未形成Tris-THT結構的54則與F-有著較弱的結合能力 (Ka=1.60 × 102 M-1) 。

圖 6

圖 7

理論計算部分，中科院有機所的薛小松課題組通過密度泛函理論（DFT）對反應進程進行了揭示（圖7）。首先以甲醛、甲胺、胍之間的反應模擬反應體系，對反應初始的兩種可能啟動路徑進行了理論計算，結果表明， pathway II中啟動步驟在動力學上更為有利。質子化的胍基57經歷脫質子化后繼續(xù)與甲醛反應生成胍的羥甲基化產物59，再質子化并脫水得到胍亞胺產物61，此時甲胺作為親核試劑進攻胍亞胺并跨越18.7kcal/mol能壘生成第一步分子間交聯產物，該途徑能夠釋放足夠的能量（ΔG= -13.1 kcal / mol），為完成整個反應提供了強大的驅動力。同時作者發(fā)現胍與胍、胺與胺的同質交聯（homo-crosslinking）產物能量均高于異質交聯產物，這為多氨基體系中優(yōu)先選擇性地發(fā)生異質交聯提供了理論依據。

綜上，陳弓教授課題通過對甲醛多組合交聯化學的拓寬和優(yōu)化，在之前工作的基礎上發(fā)展了升級版的am-a-gu反應從而實現無保護多肽的“縫合”修飾，構建出了更加復雜、新穎且具有拓撲結構的多環(huán)肽分子，豐富了復雜多肽的化學空間，相關工作最近發(fā)表在Journal of the American Chemical Society上 （DOI：10.1021/jacs.2c04620）。