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治療性α-螺旋肽已逐漸成為治療癌癥和疾病的有吸引力的候選藥物。然而，它們具有內(nèi)在的弱點(diǎn)，包括構(gòu)象穩(wěn)定性差、半衰期短和體內(nèi)清除快速。為了克服這些缺點(diǎn)，科學(xué)家提出了各種策略，包括通過共價鍵來固定α-螺旋肽結(jié)構(gòu)的肽縫合方法。另一方面，分子伴侶在生命系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，以控制蛋白質(zhì)折疊/展開并將其從部分折疊狀態(tài)引導(dǎo)至天然結(jié)構(gòu)。通過疏水片段或內(nèi)部空間，分子伴侶不僅可以捕獲未折疊的初始蛋白質(zhì)或中間體，還可以防止蛋白質(zhì)在重折疊過程中發(fā)生不可逆的聚集。在這方面，利用各種載體（如環(huán)糊精、聚合物、金屬納米顆粒、二氧化硅和自組裝納米結(jié)構(gòu)）的納米材料已被開發(fā)為人工分子伴侶。其中，多孔納米粒子由于孔徑可調(diào)、表面積大和靈活的表面修飾，在將質(zhì)粒DNA、siRNA和蛋白質(zhì)等生物大分子遞送至靶細(xì)胞方面顯示出巨大的潛力。因此，多孔納米粒子被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中最有前途的遞送載體之一，這些先前的研究啟發(fā)作者開發(fā)一種基于多孔納米粒子的肽的合成納米伴侶系統(tǒng)（SNCP），作為一種納米反應(yīng)器用于輔助治療性α-螺旋肽的正確折疊和細(xì)胞內(nèi)肽遞送（Fig. 1）。

Fig. 1: 基于多孔納米粒子的肽合成納米伴侶（SNCP）的示意圖（圖片來源：Nat. Commun.）

為了應(yīng)用人工伴侶系統(tǒng)，作者選擇了一種合成的p53肽（p53pep）作為模型治療肽。它來源于轉(zhuǎn)錄因子p53蛋白的15個殘基α-螺旋反式激活結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激。這個α-螺旋結(jié)構(gòu)域與MDM2癌蛋白的深疏水裂隙結(jié)合，作為細(xì)胞抑制劑調(diào)節(jié)p53蛋白水平。首先，作者根據(jù)先前報道的方法制備了介孔二氧化硅納米粒子，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)構(gòu)建了SNCP的納米反應(yīng)器（Fig. 2a）。

Fig. 2: SNCP的設(shè)計和表征（圖片來源：Nat. Commun.）

為了使SNCP的內(nèi)部環(huán)境更加疏水，作者在SNCP的內(nèi)表面上引入脂肪鏈，并用尼羅紅試驗進(jìn)行了驗證（Fig. 2b）。結(jié)果表明，在SNCPs內(nèi)表面引入脂肪鏈官能團(tuán)增加了其內(nèi)部環(huán)境的疏水性，這可能影響封裝肽與SNCPs之間的相互作用，使具有脂肪鏈修飾的SNCP對p53pep表現(xiàn)出更高的負(fù)載能力。受成功的表面改性結(jié)果和SNCP特性的鼓舞，作者通過在水性條件下簡單攪拌p53pep和SNCP的混合物，制備了p53pep封裝的SNCP用于后續(xù)功能研究，并用TEM和DLS進(jìn)行了一系列的證明（Fig. 2c, d）。

在SNCPs控制p53pep的α-螺旋構(gòu)象和穩(wěn)定性方面，作者應(yīng)用圓二色（CD）光譜進(jìn)行了表征，結(jié)果表明p53pep根據(jù)SNCPs的內(nèi)表面環(huán)境形成不同的二級結(jié)構(gòu)（Fig. 3a），且與SNCP0和SNCP3相比，SNCP8中的疏水環(huán)境更有利地促進(jìn)封裝的p53pep形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。封裝在SNCPs內(nèi)的α-螺旋肽p53pep的結(jié)構(gòu)構(gòu)象受到SNCP內(nèi)表面疏水性的精細(xì)控制（Fig. 3c）。此外，α-螺旋肽與SNCPs內(nèi)表面之間的疏水相互作用在提高α-螺旋肽的熱穩(wěn)定性方面起著關(guān)鍵作用（Fig. 3d）。

Fig. 3: 肽二級結(jié)構(gòu)分析（圖片來源：Nat. Commun.）

為了使p53pep在從SNCP釋放后也保持不可逆的α-螺旋結(jié)構(gòu)，作者使用銅(I)催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成（CuAAC）反應(yīng)的點(diǎn)擊肽裝訂方法合成了st-p53pep。CD光譜和FT-IR表征結(jié)果表明，三唑鍵形成降低的構(gòu)象自由度增強(qiáng)了α-螺旋肽的二級結(jié)構(gòu)（Fig. 3c, e, f, g）。SNCP8分子伴侶根據(jù)內(nèi)孔表面的疏水性增加了肽的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性。最后，作者選擇 SNCP8作為穩(wěn)定p53pep的螺旋構(gòu)象的最合適的分子納米反應(yīng)器，并將其用于體外和體內(nèi)的進(jìn)一步研究。

在SNCP作為抗癌肽遞送載體的功效方面，數(shù)據(jù)表明目前的SNCP8@st-p53pep很容易被HepG2細(xì)胞吸收，并且隨著時間的推移，負(fù)載的st-p53pep在細(xì)胞內(nèi)從SNCP8釋放，表明其作為肽的細(xì)胞內(nèi)遞送載體的潛力（Fig. 4）。

Fig. 4: 細(xì)胞實(shí)驗和細(xì)胞凋亡研究（圖片來源：Nat. Commun.）

在SNCP8@st-p53pep的細(xì)胞毒性方面，SNCP8@st-p53pep組表現(xiàn)出了較強(qiáng)的細(xì)胞毒性并呈現(xiàn)濃度依賴性，并且SNCP處理組也沒有觀察到細(xì)胞活力的顯著降低。結(jié)果表明，st-p53pep和SNCP8的協(xié)同作用成功地誘導(dǎo)了細(xì)胞毒性，而不是單獨(dú)使用SNCP8@p53pep或肽（Fig. 4）。細(xì)胞毒機(jī)制的研究表明SNCP8@st-p53pep通過p53依賴性途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡（Fig. 4d）。

最后，作者使用人肝癌（HepG2）異種移植小鼠模型評估了SNCP8@st-p53pep的體內(nèi)治療功效。SNCP8@st-p53pep治療組的腫瘤生長被顯著抑制，而單獨(dú)的SNCP8或st-p53pep組與未治療的對照組相比，腫瘤體積的生長沒有顯著差異（Fig. 5a）。這些結(jié)果表明SNCP8@st-p53pep對腫瘤生長具有抑制作用，并且SNCP8可以作為小鼠模型中治療性抗腫瘤肽的有效遞送載體。st-p53pep在體內(nèi)進(jìn)一步的可持續(xù)性分析研究表明，SNCP8不僅作為納米反應(yīng)器使p53pep的構(gòu)象更穩(wěn)定，而且還作為肽載體將st-p53pep遞送至腫瘤組織和癌細(xì)胞，可持續(xù)釋放st-p53pep并有效誘導(dǎo)p53介導(dǎo)的體內(nèi)細(xì)胞凋亡（Fig. 5）。

Fig. 5: SNCP8@st-p53pep在腫瘤小鼠模型和SNCP8@st-p53pep 治療小鼠全身成像中的治療效果研究（圖片來源：Nat. Commun.）

總結(jié)：

綜上所述，Dal-Hee Min等開發(fā)了一種基于多孔納米顆粒SNCP的合成肽納米伴侶，并證明了其在穩(wěn)定和功能性遞送治療性α-螺旋肽以控制癌癥生長方面的多種功能。SNCP的多功能性使其在目的肽的構(gòu)象穩(wěn)定性及其細(xì)胞內(nèi)遞送中表現(xiàn)出高度吸引力，該系統(tǒng)為未來各種肽療法提供了比較有前景的應(yīng)用平臺。