萜類化合物是數(shù)量龐大的一類天然產(chǎn)物，結構復雜多樣、生物活性豐富，是天然產(chǎn)物藥物研發(fā)的重要來源，目前有許多萜類藥物應用于臨床，例如倍半萜青蒿素、二萜紫杉醇、三萜雷公藤內(nèi)酯等。其中天然二倍半萜目前僅報道了1300余個，其結構骨架復雜、生物活性良好，值得深入研究和開發(fā)。如何高效挖掘新穎骨架二倍半萜類化合物，是這個領域亟待解決的問題。真菌來源的二倍半萜合酶通常含有催化異戊二烯鏈延伸和環(huán)化兩個結構域，被統(tǒng)稱為雙功能萜合酶（BFTPS）（圖1A）。目前僅報道了57個真菌雙功能二倍半萜合酶，催化形成了19種不同的結構骨架類型（圖1B），其催化產(chǎn)物結構骨架的多樣性源于雙功能萜合酶環(huán)化結構域的精密調(diào)控，因此，通過改造雙功能萜合酶環(huán)化結構域，拓展雙功能萜合酶的催化功能及其催化產(chǎn)物結構，這對新穎骨架結構二倍半萜類化合物及其生物學功能的研究與開發(fā)，具有重要的意義。 
為了高效挖掘雙功能萜合酶的催化功能及其產(chǎn)物結構多樣性，該團隊選擇真菌BFTPS作為研究對象，通過蛋白質(zhì)工程改造策略，在萜類骨架的環(huán)化反應機制研究方面取得了一定的基礎（Org. Lett. 2021, 23, 4645?4650；Chem. Commun. 2022, 58, 9476–9479；Synth. Syst. Biotechnol. 2024, 380?387）（圖1C）。進一步聚焦催化Type B型二倍半萜的BFTPS，尋找調(diào)控碳正離子中間體發(fā)生特定的環(huán)化級聯(lián)反應的關鍵功能位點，通過改造關鍵功能位點，挖掘BFTPS的催化新功能。 該研究工作選取Type B型雙功能萜合酶PfNS作為目標蛋白，其產(chǎn)物為Type B型的5/11二環(huán)二倍半萜nigtetraene（1）。基于Type B型的二環(huán)nigtetraene（1）和三環(huán)ophiobolin F（2）的環(huán)化路徑（圖2A），并結合MD模擬分析PfNS和AcOS的環(huán)化結構域催化口袋氨基酸的動態(tài)構象變化，發(fā)現(xiàn)兩者的差異氨基酸主要位于蛋白質(zhì)結構中的D-helix和G2-helix部位。D-helix上的差異氨基酸與空間相鄰的芳香族氨基酸形成簇，這些芳香族氨基酸簇可通過多種相互作用穩(wěn)定碳正離子中間體。此外，差異位點W193和T194位于G2-helix上，而G1/2-helix在不同的萜合酶中被證明可穩(wěn)定碳正離子中間體。
圖2 （A）PfNS和AcOS催化產(chǎn)物的環(huán)化路徑推導；（B）MD模擬分析PfNS和AcOS與IM1復合物的構象變化。 通過分析PfNS和AcOS與IM1的復合物軌跡（圖2B），推測推測關鍵氨基酸差異導致口袋形狀不同，從而影響催化產(chǎn)物。要將PfNS改造成AcOS，需重新排列其氨基酸布局。為了驗證假設，該作者先對PfNS進行了以下實驗：1）對這5個氨基酸位點進行丙氨酸掃描，結果顯示單點突變體失活，產(chǎn)物消失，證實這5個位點對PfNS酶催化功能的重要性；2）逐個替換AcOS的差異氨基酸，單點突變體仍失活；3）通過分析AcOS與IM1復合物的MD軌跡中G2-helix上氨基酸位點與中間體的相互作用，進行雙點突變，結果雙突變體PfNS-W193L/T194W產(chǎn)生Type A型二倍半萜3–7；4）將雙突變體中的Y113突變?yōu)镕，得到三突變體，其催化相同產(chǎn)物3–7，且產(chǎn)量是雙突變體的2.8倍；5）在三突變體上將F89突變?yōu)锳，得到四突變體，其活性口袋體積增大，產(chǎn)生了少量三環(huán)產(chǎn)物ophiobolin F（2），結果與推測相符（圖3）。為了驗證PfNS口袋的氨基酸重排規(guī)律，該作者將AcOS的差異位點突變?yōu)镻fNS對應位點。結果雙突變體和三突變體均失活。對AcOS的F66進行突變后，單點突變體F66L活性降低，生成少量二環(huán)產(chǎn)物8，驗證了PfNS和AcOS口袋的氨基酸重排規(guī)律，實現(xiàn)PfNS和AcOS催化二環(huán)和三環(huán)骨架結構的互換（圖3）。 
圖3 PfNS, AcOS及其突變體的催化產(chǎn)物鑒定。有趣的是，通過重塑PfNS環(huán)化結構域活性口袋中芳香族氨基酸簇，雙突變體PfNS-W193L/T194W催化形成5個Type A型二倍半萜產(chǎn)物，包括3個新的5/15二環(huán)產(chǎn)物（fictetraenes A–C）和2個14元大環(huán)產(chǎn)物（新產(chǎn)物 (15S,1E,2E)-cericerene和已報道的植物來源的 (2E)-cericerene）。進一步組合的三突變體PfNS-Y113F/W193L/T194W表現(xiàn)出催化活性提升， Type A型二倍半萜的產(chǎn)量是雙突變體PfNS-W193L/T194W的2.8倍。通過MD模擬分析，發(fā)現(xiàn)底物GFPP在PfNS-Y113F/W193L/T194W的活性空腔中更有利于Type A型的折疊構象?？诖鼉?nèi)的芳香族氨基酸和碳正離子中間體通過cation?π作用穩(wěn)定關鍵的碳正離子中間體，并通過C?H???π作用降低反應的活化能，有利于生成Type A型14元大環(huán)二倍半萜產(chǎn)物（圖3）。 綜上所述，該研究工作基于分子動力學MD模擬輔助的雙功能萜合酶PfNS和AcOS蛋白質(zhì)工程改造，成功實現(xiàn)了Type B型5/11二環(huán)和5/8/5三環(huán)骨架產(chǎn)物的互換，揭示了PfNS中芳香族氨基酸簇對于萜合酶Type B和Type A型催化功能轉換的精密調(diào)控（圖4）。這項研究深化了我們對于二倍半萜合酶在催化底物環(huán)化過程中的認識，為拓展萜合酶催化功能及其產(chǎn)物空間提供了一個切實可行的全新策略。
圖4 重新編排ARC調(diào)控PfNS和AcOS催化功能轉化劉雪婷教授和王馨葉博士為該論文的共同通訊作者，博士研究生張維燕為該論文的第一作者。該研究工作得到了張立新教授的長期指導和大力支持、加拿大圭爾夫大學（University of Guelph）Tom Hsiang教授的多年合作和指導、中山大學巫瑞波教授和日本北海道大學（Hokkaido University）Hideaki Oikawa教授的指導，華東理工大學藥學院朱彬博士在單晶測試和分析方面提供了幫助。該研究工作得到了國家自然科學基金（21977029, 81903529, 31720103901, 22307037），國家重點研發(fā)計劃（2020YFA090032 和 2022YFC2105400），中國博士后科學基金項目（2019M661403），111引智計劃（B18022），上海市科學技術委員會（21NL2600100），以及生物反應器工程國家重點實驗室開放項目等項目基金的支持。 張立新團隊聚焦“天然藥物的高效發(fā)現(xiàn)與量產(chǎn)”研究主線，2024年取得了一系列原創(chuàng)性新發(fā)現(xiàn)（2024年6月5日在Nat. Biotechnol.長文在線發(fā)表血紅素及卟啉化合物的高效生物制造；Nat. Prod. Rep. 2024；Trends Biotechnol. 2024；Angew. Chem. 2024）。劉雪婷課題組以“微生物天然藥物的高效發(fā)現(xiàn)”為研究主線，多年來致力于利用合成生物學策略合成“非天然”的活性天然產(chǎn)物及生物合成關鍵酶的催化機制研究，以通訊或共通訊作者發(fā)表于Angew Chem，JACS Au，Nat Prod Rep，Org Lett，Cell Chem Biol，Chem Commun 等學術論文50余篇，授權專利11件（轉讓1件）。歡迎感興趣的青年學子加入我們（liuxueting@ecust.edu.cn）。
Function Switch of a Fungal Sesterterpene Synthase through Molecular Dynamics Simulation Assisted Alteration of an Aromatic Residue Cluster in the Active Pocket of PfNS.Weiyan Zhang, Xinye Wang, Guoliang Zhu, Bin Zhu, Kaitong Peng, Tom Hsiang, Lixin Zhang, Xueting Liu.Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202406246.
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