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近日，云南大學醫(yī)學院尹敏課題組聯(lián)合中國科學院昆明植物研究所黃勝雄研究員課題組，在催化領域知名期刊ACS Catalysis上發(fā)表了題為“Uncovering the Parallel Biosynthetic Pathways of the Cyclohexanone and Phenol Rings in Cycloheximide and Actiphenol by Tailoring Redox Enzymes”的研究論文。該研究揭示了苯酚和環(huán)己酮在相同生物合成機制下形成的一種罕見且不同的級聯(lián)氧化還原機制，涉及由羧酸還原酶和CYP450協(xié)同催化PKS產(chǎn)物引發(fā)的分子內(nèi)羥醛縮合反應。這一發(fā)現(xiàn)擴展了對天然藥物分子生物合成中氧化還原酶介導的酚和環(huán)己酮基團形成的理解，并為未來的組合生物合成新藥研發(fā)奠定了基礎。近年來，尹敏研究團隊以云南本地多種中草藥為研究對象，構建了藥用植物內(nèi)生放線菌庫，通過多組學聯(lián)合運用高效發(fā)現(xiàn)了系列高潛力菌株，獲得了多個活性新天然產(chǎn)物，進而開展了生物合成機制的研究。

真核細胞翻譯抑制劑放線菌酮（cycloheximide, CHX）及其類似物放線菌酚（actiphenol, APN）都具有特殊的戊二酰亞胺結構和六元碳環(huán)側鏈基團。APN與CHX的區(qū)別在于其含有芳香酚環(huán)而非環(huán)己酮基團。在前期的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)工作中，作者注意到多株產(chǎn)生CHX的菌株能夠同時發(fā)現(xiàn)有APN的產(chǎn)生（Highet et al. Helv Chim Acta, 1959；Rao et al. J Org Chem, 1960；Huang et al. J Antibiot, 2011；Liu et al. Front Microbiol,2022）?；谶@一現(xiàn)象，作者團隊推測CHX和APN可能通過同一生物合成途徑進行合成（Yin et al. Org Lett, 2014），并提出了后修飾苯環(huán)脫芳可能是形成這兩種化合物的關鍵機制。然而，這一假設主要得到了chxG或chxH基因敲除實驗的支持，而缺乏相應的體外實驗證據(jù)（圖1B）。此外，由于常溫常壓下苯環(huán)難以實現(xiàn)脫芳化，六元碳環(huán)的形成機制仍存在不確定性。為了更深入地理解CHX和APN中兩個不同基團的生物合成機制，作者選擇了菌種庫中能同時大量產(chǎn)生這兩種化合物的藥用植物內(nèi)生放線菌Streptomyces sp. YINM00100作為研究對象，對其生物合成基因簇進行了詳細分析（圖1A）。研究發(fā)現(xiàn)，四種后修飾酶：烯酰還原酶（ChxG）、酮還原酶（ChxH）、細胞色素P450 (ChxI）和三結構域羧酸還原酶（ChxJ）可能參與新生聚酮中間體3的后修飾（圖1B）。

圖1：(A) chx和chx- YINM00100 BGC的基因簇比較。(B)前期研究提出的CHX和APN的生物合成途徑。(C)由化合物7化學合成化合物3和8

在先前的研究中，作者通過體內(nèi)敲除chxE、chxJ、chxI、chxG和chxH基因來探究它們在生物合成途徑中的作用。除了ChxH外，其他三種酶的體外功能尚未確定。在本研究中，作者構建了chxJ、chxI和chxG基因敲除突變株，證明了chxJ和chxI在CHX和APN的生物合成中都起著重要作用，此外，菌株YINM00100的基因組中可能存在一個類似的基因可以補償chxG的功能（圖2A）。通過大規(guī)模發(fā)酵菌株Streptomyces himastatinicus ATCC 53653獲得了足量的9-methylstreptimidone（化合物7），并通過化學合成得到了化合物3（圖1C）。接下來通過酶學實驗證明ChxJ能夠以3為底物，以ATP和NADPH為輔助因子生成化合物8。用氧化劑DMP處理了中間體8，大部分底物轉化為APN，但沒有轉化為中間體5，這表明8中的C-8羥基氧化導致自發(fā)環(huán)化，然后芳構化生成APN（圖2B）。綜上得出，ChxJ的A結構域激活并加載3到ACP上，接著ChxI將3-S-ACP中的C-8羥基氧化，最后由ChxJ的R結構域還原硫酯鍵獲得化合物4，最后通過自發(fā)地分子內(nèi)羥醛縮合和脫水芳構化形成APN（圖2C和1B）。

圖2：(A)野生型和突變株的HPLC圖譜。 (B) (iv) ChxJ與3孵育。 (C) ChxJ和ChxI與3孵育。

ChxJ和ChxI的組合足以產(chǎn)生APN，而ChxH和ChxG對于CHX的生物合成至關重要，這與作者早期的體內(nèi)敲除實驗結果一致。ChxH負責CHX生物合成途徑的最后一步已經(jīng)在先前報道的文章中證實，接下來重點研究ChxG。實驗結果顯示，化合物8能被ChxG還原為化合物9（圖3A），這表明ChxG在CHX生物合成中的作用是介導不穩(wěn)定的醛化合物4的C12-C13雙鍵還原，生成新的中間體10，該中間體隨后可自發(fā)進行醛醇縮合脫水生成11（圖3B、圖4）。隨后將ChxJ、ChxI和ChxG組合在一起，以3為底物進行了一鍋反應，證明了化合物4是ChxG的真實底物（圖3C）。而化合物11可以在非酶催化條件下轉化為化合物6（圖3D）。此外，找到了一個ChxG的同源蛋白，并通過體外實驗驗證了其具有ChxG相同的活性。驗證了ChxG在底物還原過程中的立體選擇性與天然放線菌酮生物合成過程中C12和C13雙鍵還原時的立體選擇性是一致的（圖5A）。最后，通過分子模擬對接分析以及后續(xù)點突變蛋白的構建，證明了氨基酸H162、H165和Y167對ChxG的還原活性起著至關重要的作用（圖5B）。

圖3：ChxG的體外酶促反應。(A)

ChxG化合物8生成9。 (B）由化合物1（CHX）化學合成化合物11和6。（C) ChxI、ChxJ和ChxG與3孵育，11易于發(fā)生酮烯醇互變異構生成11a。（D） NADPH在添加或不添加ChxG的情況下分別與11共孵育。

圖4：新推導的CHX和APN的生物合成途徑。

圖5：(A) 手性HPLC圖譜。 (B)化合物8與ChxG活性口袋對接。

至此，CHX和APN的生物合成途徑的細節(jié)，包括六元碳環(huán)系統(tǒng)的生物合成的新機制得到了完整解析。本研究表明，CHX和APN并非如先前推測的那樣由APN催化氫化產(chǎn)生CHX，而是自trans-AT PKS合成了碳骨架后，通過兩個平行的途徑分別產(chǎn)生的。兩種氧化還原酶（ChxJ和ChxI）可以單獨產(chǎn)生一種活性中間體，該中間體經(jīng)歷一系列非酶轉化以產(chǎn)生APN，而還原酶（ChxG）則作為看門人，將同一中間體引導到產(chǎn)生CHX的合成途徑。該研究對作者團隊于2014年提出的假設（Yin et al. Org Lett, 2014）進行了進一步修正，擴展了對天然產(chǎn)物生物合成中氧化還原酶介導的酚和環(huán)己酮基團形成的理解，并為未來的組合生物合成研究奠定了基礎。

云南大學醫(yī)學院尹敏副研究員和中國科學院昆明植物研究所黃勝雄研究員、顏一軍研究員為文章共同通訊作者。上述工作得到了國家自然科學基金（82225043、 32271523 、82160674），中國科學院戰(zhàn)略生物資源計劃（KFJBRP-009-005）和云南省自然科學基金（202201AS070007）等項目的支持。
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.4c03332