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Angew:非天然氨基酸助力納米孔道多肽單分子測序

來源:南京大學(xué)      2023-05-22
導(dǎo)讀:近日,南京大學(xué)龍億濤教授團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)陳鵬教授團(tuán)隊(duì)通過長期的共同合作與探索,將基于吡咯賴氨酸的遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)應(yīng)用于Aerolysin納米孔道界面。

納米孔道蛋白質(zhì)單分子測序技術(shù)的關(guān)鍵問題之一是如何提高現(xiàn)有納米孔道傳感界面的空間分辨能力。近日,南京大學(xué)龍億濤教授團(tuán)隊(duì)與北京大學(xué)陳鵬教授團(tuán)隊(duì)通過長期的共同合作與探索,將基于吡咯賴氨酸的遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)應(yīng)用于Aerolysin納米孔道界面。經(jīng)過4年的摸索及體系優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)將非天然氨基酸高效地引入了納米孔道的傳感區(qū)域內(nèi),從而設(shè)計(jì)調(diào)控了孔道識(shí)別靈敏域內(nèi)每一個(gè)氨基酸殘基的空間取向,獲得了三維化學(xué)及物理環(huán)境可控的蛋白質(zhì)孔道界面,有效提高了納米孔道對(duì)單個(gè)多肽分子的空間分辨能力(圖1)。


1. 非天然氨基酸構(gòu)建的納米孔道靈敏域用于多肽單分子分析。

雙方團(tuán)隊(duì)通過篩選高效的氨酰tRNA合成酶和優(yōu)化Aerolysin蛋白的表達(dá)條件,將非天然氨基酸插入的成孔蛋白產(chǎn)量提高至5 mg/L(圖2)。大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,該成孔蛋白的開孔電流標(biāo)準(zhǔn)差與野生型孔道蛋白相當(dāng),證明了遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)的高產(chǎn)物均一性。


2.非天然氨基酸編碼的Aerolysin成孔蛋白高表達(dá)體系。

進(jìn)一步,通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和納米孔道單分子電化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了非天然氨基酸構(gòu)建的傳感區(qū)域。相較于天然疏水氨基酸殘基在Aerolysin孔道內(nèi)的貼壁行為,較長的芳香族非天然氨基酸側(cè)鏈在孔道內(nèi)呈現(xiàn)有利于多肽檢測的立體幾何構(gòu)象,形成一個(gè)針對(duì)多肽上芳香族氨基酸識(shí)別的傳感靈敏域。該非天然氨基酸構(gòu)建的納米孔道將單個(gè)多肽分子在孔道內(nèi)的阻斷時(shí)間延長了十倍,實(shí)現(xiàn)了對(duì)混合樣品中不同長度多肽分子的精準(zhǔn)區(qū)分(圖3)。


3.非天然氨基酸構(gòu)建納米孔道的全原子模型以及多肽單分子分析。

該方法突破了傳統(tǒng)生物納米孔道修飾方法的局限,建立了非天然氨基酸編碼的成孔蛋白高表達(dá)體系,為用于多肽測序的超靈敏納米孔道的理性設(shè)計(jì)開辟了新道路。

相關(guān)成果以“Controlled Genetic Encoding of Unnatural Amino Acid in Protein Nanopore.”為題,發(fā)表于德國應(yīng)用化學(xué)(Angewandte Chemie International Edition, DOI 10.1002/anie.202300582, 文章鏈接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202300582。我院博士后武雪原博士為論文第一作者,應(yīng)佚倫教授和北京大學(xué)陳鵬教授為論文的共同通訊作者,該工作得到了科技部國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2022YFA1304604)、國家自然科學(xué)基金(2202780622090050)及中國博士后科學(xué)基金(2021M691509)的資助。


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