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氨基酸已被廣泛應(yīng)用于食品、動物飼料、制藥和化妝品行業(yè)。到2026年，全球氨基酸市場價值預(yù)計將達(dá)到296億美元，復(fù)合年增長率(CAGR)為6-8%。微生物發(fā)酵是氨基酸生產(chǎn)的主要方法，占全球氨基酸產(chǎn)量的80%。而發(fā)酵的關(guān)鍵是獲得高性能的發(fā)酵菌株。目前，氨基酸高產(chǎn)菌株的選育主要依靠構(gòu)建突變庫和后續(xù)篩選，突變庫的建立方法已經(jīng)較為成熟，而篩選策略往往決定了是否可以獲得理想的氨基酸高產(chǎn)菌株。

圖1 氨基酸的生產(chǎn)現(xiàn)狀及AMINO策略的示意圖

本團(tuán)隊(duì)長期從事氨基酸及其衍生物的生物合成及高產(chǎn)菌株篩選策略的研究，2018年，以“Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers”為題，在頂級期刊《Nature Communications》（影響因子：17.694）上發(fā)表（https://www.nature.com/articles/s41467-018-05830-0/）。該工作首次提出了一種基于稀有密碼子的新型氨基酸高產(chǎn)菌株篩選策略。這種策略使用稀有密碼子抑制標(biāo)記基因的翻譯，高產(chǎn)目標(biāo)氨基酸的菌株可以更加高效地表達(dá)富含稀有密碼子的標(biāo)記基因，從而產(chǎn)生可被選擇的表型。這種策略適用于10種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和各種工業(yè)宿主的高產(chǎn)菌株篩選，其可操作性和普適性得到了極大的提升。

圖2 基于稀有密碼子的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選策略的原理

為了進(jìn)一步拓展基于翻譯過程的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選策略，將其推廣至全部20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸甚至非蛋白質(zhì)氨基酸的高產(chǎn)菌株篩選，本團(tuán)隊(duì)此次提出了一種基于人造tRNA_CUA的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選策略（AMINO）。

氨?；且环N兩步多底物反應(yīng)，其速率不僅取決于兩種主要底物tRNA和氨基酸的濃度，還取決于它們各自與氨?；厦福╝aRS）的親和力。抑制這些因素中的任何一個都會破壞氨?；^程，而促進(jìn)其他因素應(yīng)該可以補(bǔ)償這種負(fù)面影響?；谶@一原理，可以根據(jù)目標(biāo)氨基酸，使用與aaRS或aaRS-aa親和力降低的tRNA，篩選目標(biāo)氨基酸的高產(chǎn)菌株。其中，改造tRNA的反密碼子是一種通用且簡便的降低其與aaRS親和力的方法。而在所有64個密碼子中，琥珀密碼子UAG通常不編碼氨基酸，將tRNA的反密碼子更改為UAG互補(bǔ)三聯(lián)體（CUA）提供了一種通用的解決方案，既可以降低tRNA與同源aaRS的親和力，又可以防止干擾其他氨基酸的正常翻譯。

圖3 基于人造tRNA_CUA的篩選策略用于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選

基于上述原理，本團(tuán)隊(duì)提出了一種基于人造tRNA_CUA的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選策略。作為概念驗(yàn)證，通過基于生長和/或熒光激活細(xì)胞分選（FACS）的篩選，分別從大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的隨機(jī)突變庫中篩選出L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-天冬氨酸等五種氨基酸的高產(chǎn)菌株，并構(gòu)建了L-半胱氨酸，L-賴氨酸，L-甘氨酸和L-谷氨酸以及兩種非蛋白質(zhì)氨基酸（5-羥基色氨酸和3-甲基-組氨酸）的選擇系統(tǒng)。為了進(jìn)一步降低篩選標(biāo)記的設(shè)計難度和提高本策略的通用性，在氯霉素抗性基因 cm 的5′末端添加了一段富含UAG的Tag序列，建立了一種改進(jìn)的篩選標(biāo)記。這種標(biāo)記基因可以適用于對所有氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選，并且可以通過簡單的PCR法改變UAG的數(shù)量，來調(diào)節(jié)篩選強(qiáng)度的大小。隨后，還證明了該策略可以被推廣至大腸桿菌MG1655，XL10-gold，C321.?A和谷氨酸棒狀桿菌。

圖4 基于人造tRNA_CUA的篩選策略用于非蛋白質(zhì)氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選

最后，本文對篩選出的色氨酸高產(chǎn)菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析，通過差異基因表達(dá)分析鑒定了 41 個參與芳香族氨基酸生物合成、糖酵解途徑 (EMP) 和磷酸戊糖途徑（PP）的基因。結(jié)果表明，通過增強(qiáng) L-色氨酸生物合成途徑以及抑制競爭和降解途徑來調(diào)節(jié)輔因子和代謝流重定向有利于L-色氨酸的生產(chǎn)，這些分析可能有助于重構(gòu)氨基酸高產(chǎn)菌株，突破現(xiàn)有菌株的生產(chǎn)天花板。

圖5 通用型氨基酸高產(chǎn)菌株篩選標(biāo)記

總之，這項(xiàng)工作為氨基酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選提供了一種通用、便捷且無毒的策略，極大地提升了氨基酸高產(chǎn)菌株篩選策略的可操作性，普適性和通量。僅需引入改造后的tRNA和篩選標(biāo)記基因，即可實(shí)現(xiàn)對20種天然氨基酸、各種非蛋白質(zhì)氨基酸、用于氨基酸生物合成的高效酶和生物元件以及氨基酸衍生物的高產(chǎn)菌株篩選。該策略背后的機(jī)制可能會為構(gòu)建用于參與其他雙底物反應(yīng)的底物高產(chǎn)菌株提供新的思路。

此外，本團(tuán)隊(duì)還系統(tǒng)地總結(jié)了氨基酸高產(chǎn)菌株篩選領(lǐng)域的最新進(jìn)展，相關(guān)成果 以  “  Recent  advances  in  screening  amino  acid  overproducers ”  為 題，在《Engineering Microbiology》期刊上發(fā)表（doi.org/10.1016/j.engmic.2022.100066），北京理工大學(xué)為第一通訊單位，博士研究生妥俊愷為第一作者。該工作全面回顧了基于營養(yǎng)缺陷型、基于生物傳感器和最新的基于翻譯過程的氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選策略，詳細(xì)討論了這些策略的設(shè)計原則、應(yīng)用范圍、工作效率、篩選精度和普適性。

圖6 常用的氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選策略

該項(xiàng)工作得到了國家自然科學(xué)基金（Grant No. 32000059）、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（Grant No. 2019YFA0906500和2019YFA0904104）和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金的支持，也感謝北京理工大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程公共實(shí)驗(yàn)中心的支持。