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作為分子生物學(xué)中逐步興起的RNA表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，RNA化學(xué)修飾在多種疾病中的作用被逐步闡明。其中，m⁶A修飾作為豐度最高的修飾之一已被證實可影響多種疾病中的關(guān)鍵致病基因組的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。ALKBH5作為m⁶A修飾的擦除器蛋白，其可通過調(diào)控RNA中m⁶A修飾從而影響疾病進(jìn)展，在急性髓系白血病中，ALKBH5的過表達(dá)導(dǎo)致下游致癌基因轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定性增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致致癌蛋白過表達(dá)最終導(dǎo)致癌癥惡性進(jìn)展。目前通過化學(xué)小分子干預(yù)調(diào)控其活性仍然存在巨大挑戰(zhàn)。

圖1 18l的ALKBH5抑制活性及共價作用機(jī)制驗證

Cys200殘基作為ALKBH5特有的非催化共價位點(diǎn)，位于ALKBH5的ssRNA底物結(jié)合口袋附近，研究人員設(shè)想通過靶向該位點(diǎn)進(jìn)行共價修飾，從而干擾底物與ALKBH5結(jié)合，起到選擇性活性抑制作用。通過前期篩選及構(gòu)效關(guān)系研究，研究人員得到了以馬來酰亞胺作為共價彈頭的優(yōu)選化合物18l（ALKBH5 IC₅₀ = 620 nM）。通過多種體外實驗，證實了18l是通過共價修飾Cys200抑制ALKBH5酶活性，且該種修飾可阻止底物結(jié)合ALKBH5。此外，對于FTO和多種Cys蛋白酶，18l具有對ALKBH5的良好選擇性。

圖2 18l在血液瘤細(xì)胞中的抗腫瘤作用研究

在體外驗證化合物18l對ALKBH5的抑制活性后，研究人員對化合物的細(xì)胞水平活性進(jìn)行了測試。結(jié)果表明化合物18l可以抑制AML細(xì)胞增殖（NB4 cell IC₅₀ = 630 nM），促進(jìn)AML細(xì)胞凋亡、分化為正常細(xì)胞、阻滯細(xì)胞周期，并抑制細(xì)胞內(nèi)ALKBH5介導(dǎo)的信號通路表達(dá)，此外，18l可提升NB4細(xì)胞內(nèi)RNA中m⁶A水平，表明化合物可在胞內(nèi)抑制ALKBH5。

圖3 18l的靶向性及作用機(jī)制研究

為驗證18l的酶水平ALKBH5抑制活性與抗AML細(xì)胞表型的關(guān)聯(lián)性，研究人員進(jìn)行了非修飾的靶向性驗證以及基于ABPP的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在非修飾性實驗中，18l可改變ALKBH5的蛋白酶耐受性、熱穩(wěn)定性從而證明了化合物的胞內(nèi)在靶性。ABPP蛋白質(zhì)組學(xué)實驗中，基于18l的化學(xué)探針可結(jié)合ALKBH5，質(zhì)譜結(jié)果證實了18l在AML細(xì)胞內(nèi)可結(jié)合ALKBH5。

圖4 18l的體內(nèi)抗腫瘤藥效學(xué)研究

最后，研究人員在AML細(xì)胞小鼠異種移植瘤模型中進(jìn)行了18l的體內(nèi)抗腫瘤藥效學(xué)研究，在1 mg/kg和2.5 mg/kg給藥劑量下，18l均可有效抑制腫瘤生長，抑瘤率分別為66.3%和76.8%，且動物體重未出現(xiàn)明顯下降，展現(xiàn)出了該化合物的良好體內(nèi)藥效。

柳紅/楊財廣/李淳樸團(tuán)隊報道了一種靶向Cys200共價抑制ALKBH5的小分子18l。該化合物表現(xiàn)出強(qiáng)效的ALKBH5抑制活性和較好的選擇性，在針對AML的體外和體內(nèi)藥效學(xué)研究中顯示出優(yōu)秀的抗腫瘤作用。通過CETSA、DARTS以及基于ABPP的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)等多種化學(xué)生物學(xué)手段進(jìn)行了深入的作用機(jī)制驗證，闡明了ALKBH5抑制劑18l發(fā)揮抗AML作用的機(jī)制，為RNA表觀遺傳領(lǐng)域的精準(zhǔn)化學(xué)調(diào)控提供了新的指導(dǎo)思路。

中國科學(xué)院上海藥物研究所柳紅研究員、楊財廣研究員、李淳樸研究員為本論文共同通訊作者，中國科學(xué)院上海藥物研究所博士研究生吳恒搏、賴淦強(qiáng)、程瑞翔為本論文共同第一作者。該項工作得到了中國科學(xué)院上海藥物研究所周虎研究員的支持。該項研究獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會的資助。