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130多年前，德國生物學家阿爾布雷希特·科塞爾首次從茶葉中提取茶堿。茶堿（theophylline，TEP）作為一種支氣管擴張劑，能擴張支氣管平滑肌、降低氣道反應性并具有抗炎作用，在臨床上用于治療慢性阻塞性肺疾病、哮喘和嬰兒呼吸暫停等呼吸系統(tǒng)疾病。然而，其治療濃度窗口較窄，需嚴格監(jiān)測濃度，以免高濃度引發(fā)嚴重不良反應。茶堿特異性適體（如短單鏈DNA或RNA）以高特異性、低成本及低免疫原性的優(yōu)勢，可作為茶堿的生物傳感器用于濃度檢測。特異性識別茶堿的RNA適體于1994年由Jenison等人發(fā)現，其配體結合機制已被闡明，茶堿DNA適體于2022年由劉玨文團隊開發(fā)，其能特異性識別并結合茶堿而不結合咖啡因，這兩個小分子僅有一個甲基的區(qū)別。同時其對茶堿的親和力明顯優(yōu)于3-甲基黃嘌呤（3-methylxanthine，3-M）和次黃嘌呤（hypoxanthine，HPA），目前，其結構尚未解析，配體識別機制仍不明。

核酸適體主要通過指數富集的配體系統(tǒng)進化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）篩選獲得，但其實驗周期長、操作復雜且特異性難以保證，成本效益限制了其大規(guī)模應用。近年來，多個研究小組成功利用天然核糖體開關或核酶作為支架，篩選有效新適體，但仍未完全克服傳統(tǒng)SELEX實驗的局限。

茶堿DNA適體整體上呈現莖環(huán)結構，包含兩個莖（P1、P2）和一個配體結合口袋區(qū)，配體結合口袋區(qū)由兩個連接區(qū)J1/2和J2/1組成，表面視圖展示單一的半封閉的配體結合口袋結構（圖1）。5個脫氧核苷酸（G1到T5）形成了P1莖的第一條鏈。然后，該鏈延伸到第一個連接區(qū)（J1/2），該連接區(qū)（G6到C9）形成配體結合口袋區(qū)域的第一條鏈。之后，DNA鏈通過向下伸展的堿基（T10）延伸到P2，該堿基是閉合結合袋的關鍵核苷酸。A11和T12形成了P2的第一條鏈。隨后，它與兩個脫氧核苷酸（T13和C14）形成一個莖環(huán)，然后向下彎曲形成P2的第二條鏈（A15和T16）。繼續(xù)向下，DNA鏈進入第二個連接區(qū)（J2/1），呈現S-turn結構，同時形成配體結合口袋區(qū)的第二和第三鏈（A17到C24，其中A17-G19屬于第二鏈，G21-C24屬于第三鏈）。最后，DNA鏈完成了P1莖的第二條鏈（G25到C29）。整體結構的表面視圖展示了一個單一的半封閉的配體結合口袋。

圖1. 茶堿DNA適體的整體結構

茶堿DNA適體核心區(qū)域為其配體結合口袋區(qū)域，位于P1和P2之間，如圖2a所示。該區(qū)域始于P1的G25?T5堿基對，由四個三堿基相互作用平面組成，每個平面都有廣泛的氫鍵相互作用，其中第三個平面是配體結合位點。第一個三堿基相互作用平面涉及G19-（trans Watson–Crick–Hoogsteen）-G6-（cis Watson–Crick）-C24（圖2b），第二個三堿基相互作用平面G18：G7：C23與第一個類似（圖2c)。配體結合位點內的小分子與A17和T22形成氫鍵，在第二和第四個三堿基相互作用平面之間形成一個中間面板。第四層三堿基相互作用平面包括一個從C9 N4到T8 O2的氫鍵和一個C9-（cis Watson–Crick）-G21的堿基對（圖2d）。

在茶堿DNA適體分別結合TEP、3-M和HPA的結構中，每個化合物的嘌呤環(huán)與A17的嘌呤環(huán)和T22的嘧啶環(huán)共面對齊，同時形成氫鍵。在結合TEP的結構中，嘌呤環(huán)的O6和N9接受A17 N6和T22 N3的氫鍵，而N7向A17 N1提供一個氫鍵（圖2e）。正是由于N7位置的甲基取代，該甲基破壞了與A17 N1的氫鍵相互作用導致該適體無法識別和結合咖啡因。在結合3-M的結構中，與A17和T22可以觀察到一致的氫鍵相互作用（圖2f）。盡管HPA的親和力比TEP低2000倍，但作者成功地解析了與HPA結合的茶堿DNA適體的晶體結構，HPA嘌呤環(huán)的N1向A17 N1提供一個氫鍵，而N3和O6分別接受T22 N3和A17 N6的氫鍵（圖2g）。

圖2. 茶堿DNA適體的配體結合口袋結構和配體識別結合

作者通過生化實驗電泳遷移率變化分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）和等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）驗證了茶堿DNA適體配體識別結合機制（圖3）。基于結構分析設計的特定堿基突變（A17G、T22C和A17G+T22C）破壞了適體與茶堿的氫鍵形成導致適體無法結合茶堿，進一步驗證了晶體結構中觀察到的氫鍵相互作用的正確性。

圖3. 新適體開發(fā)策略和生化驗證

基于上述配體結合機制，作者提出了一個合理設計的靶向茶堿類似物的適體開發(fā)策略。配體結合袋由四個平面結構域組成，并通過核苷酸A17和T22的氫鍵相互作用來穩(wěn)定。作者假設，配體相互作用的堿基（A17和T22）的定向突變可以在保留整體拓撲結構的同時，可以形成特異性識別茶堿類似物的新適體（圖4a）。為了驗證這一假設，文章作者在這兩個位置進行了系統(tǒng)突變（合計15個變異，不包括野生型），并使用Glide XP進行了分子對接模擬，以預測與15個茶堿類似物的結合親和力。值得注意的是，preQ1和腺嘌呤作為配體出現，并可能與特定的突變體結合。突變體DNA-C-T對preQ₁表現出最佳的對接分數，超過了野生型（DNA-A-T）和DNA-C-C。此外，突變體DNA-T-T對腺嘌呤表現出優(yōu)越的親和力，突變體DNA-C-T次之（圖4b）。這些計算預測結果通過ITC實驗進行了驗證。對于preQ₁，DNA-C-T表現出強結合（Kd = 1.3 μM），而野生型表現出中等親和力（Kd = 9.0 μM），其他突變體表現出弱結合或無結合（圖4c）。DNA-C-T是目前第一個報道的preQ₁ DNA適配體。同樣，DNA-T-T對腺嘌呤具有中等親和力（Kd = 57 μM），與野生型弱結合（Kd = 203 μM）形成鮮明對比，在其他突變體中相互作用可以忽略（圖4d）。通過ITC進行的特異性分析顯示了獨特的配體識別：DNA-C-T選擇性識別結合preQ₁，而不結合其類似物（TEP、3-M、HPA、GMP/GDP/GTP，圖4e），同樣DNA-T-T特異性識別結合腺嘌呤，而不結合其類似物（TEP、3-M、HPA、AMP/ADP/ATP，圖4f），這種特異性與計算預測相一致。

圖4. 新適體開發(fā)策略和生化驗證

作者同時也解析了DNA-T-T結合腺嘌呤的晶體結構，腺嘌呤結合模式與計算模擬預測的結合模式一致，表明開發(fā)適體的靶向突變策略是成功的。腺嘌呤適體的整體結構包括三個莖（P1、P2和P3）和兩個與腺嘌呤結合的核心區(qū)域，根據虛線可以分為具有鏡像對稱的兩部分。每個核心區(qū)域包含一個腺嘌呤結合位點（圖5a，b）。該結構的各個部分顯示了一個與茶堿適體一致的配體結合核心區(qū)域（圖5c，d）。腺嘌呤在第三平面上形成廣泛的氫鍵相互作用，嘌呤環(huán)的N1和N3接受T17 N3和T22 N3的氫鍵，而N6和N9分別向T17 O4和T22 O2提供氫鍵（圖5e）。

圖5. 所設計的腺嘌呤DNA適體的結構驗證

中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院林曉偉、黃園尹和中山大學藥學院黃錦超為論文共同第一作者。中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院黃林研究員與黃健教授、廣州實驗室苗智超研究員和中山大學藥學院陳碩斌教授為論文共同通訊作者。

本團隊正在招聘博士后若干名，要求是已獲得（或即將獲得）生物學或醫(yī)學尤其是適配體篩選與應用、酶學、微生物學、分子生物學或結構生物學研究方向的博士學位。感興趣的申請人可將個人的完整簡歷（如果有論文發(fā)表，請附全文）以及其它相關資料以PDF格式發(fā)送至huanglin36@mail.sysu.edu.cn.